Peptidetesting

Entenda os testes antes de confiar neles

GC-MS vs. LC-MS: Qual método usar quando?

Para peptídeos, LC-MS é o caminho usual: a cromatografia líquida separa, a espectrometria de massas pesa. GC-MS precisa de substâncias voláteis - peptídeos intactos não são. Um COA diz o que foi medido - mas apenas para essa amostra específica.

Qual é a diferença entre GC-MS e LC-MS?

A principal diferença entre GC-MS e LC-MS está no estado físico da separação: a GC-MS separa substâncias na fase gasosa, enquanto a LC-MS usa a fase líquida. Para peptídeos, a LC-MS é o método padrão, pois essas cadeias de aminoácidos ficam estáveis em líquidos e podem ser analisadas com precisão nesse estado.

Um espectrômetro de massas mede a razão massa-carga (m/z) dos íons, o que, de forma simples, equivale a pesar as moléculas. Enquanto a cromatografia gasosa (GC) vaporiza a amostra, a cromatografia líquida (LC) a dissolve em um solvente. A determinação de massa depois funciona da mesma forma após os dois métodos de separação.

Por que peptídeos intactos não são adequados para GC-MS?

Peptídeos intactos não são compatíveis com GC porque a cromatografia gasosa (GC) exige substâncias voláteis que não se decompõem ao serem vaporizadas. Como os peptídeos são moléculas complexas e apolares, eles precisariam ser quimicamente transformados (derivatizados) ou quebrados em aminoácidos para uma análise por GC, o que impede o exame da molécula intacta.

Até mesmo aminoácidos individuais precisam ser tornados voláteis por derivatização para a análise por GC-MS. Na literatura especializada, não existe um método para peptídeos intactos usando GC-MS. Em vez disso, as amostras são frequentemente hidrolisadas, ou seja, quebradas em aminoácidos, ou diretamente analisadas com o método mais adequado, a LC-MS.

Como funciona a análise por LC-MS em peptídeos?

A análise por LC-MS primeiro separa os peptídeos em uma coluna líquida e, depois, determina seu peso exato no espectrômetro de massas. A cromatografia líquida (LC) usa a interação das substâncias com a coluna para a separação, enquanto a espectrometria de massas (MS) fornece a razão massa-carga (m/z) das moléculas como sinal.

Para peptídeos, geralmente se usa a ionização por electrospray (ESI) para converter as substâncias dissolvidas em íons. Para que a ionização não seja perturbada, sais ou detergentes interferentes devem ser removidos antes. Uma única corrida de LC-MS é capaz de quantificar milhares de peptídeos diferentes ao mesmo tempo.

Quais vantagens a espectrometria de massas oferece em comparação com a detecção UV?

A espectrometria de massas oferece segurança adicional em comparação com a detecção UV pura (HPLC-UV), pois mede a massa molecular exata em vez de apenas o tempo de retenção. Enquanto a detecção UV apenas identifica quando uma substância sai da coluna, a análise por MS confirma a identidade do peptídeo por seu peso específico.

Isso é comparável a um amigo que você reconhece na estação não apenas pelo horário de chegada, mas também o identifica pesando-o. A LC-MS fornece tanto o tempo quanto a massa. Com a espectrometria de massas em tandem (MS/MS), a molécula também pode ser quebrada em fragmentos, o que assegura ainda mais a identidade, enquanto a UV-HPLC não consegue distinguir substâncias que coeluem.

O que significam HPLC, LC-MS e GC-MS em um COA?

O nome do método em um COA (Certificate of Analysis) descreve a profundidade da verificação de identidade: HPLC geralmente significa uma medição UV do tempo, LC-MS uma determinação adicional de massa. A designação LC-MS/MS indica uma forma estendida com fragmentação, que permite uma identificação ainda mais específica dos peptídeos.

GC-MS em um COA de peptídeos é incomum, pois peptídeos intactos não podem ser analisados por cromatografia gasosa. Se esse método for listado mesmo assim, o laboratório precisaria explicar o pré-tratamento da amostra. Isso geralmente é feito pela hidrólise do peptídeo em seus aminoácidos individuais.

Por que um resultado de COA se refere apenas à amostra testada?

Um resultado de COA é válido apenas para a amostra enviada, pois cada método de análise é validado especificamente para uma determinada matriz - ou seja, o ambiente de excipientes e impurezas. De acordo com as diretrizes ICH, o laboratório documenta a especificidade e a pureza exclusivamente para a peça individual testada, não automaticamente para um lote inteiro.

O princípio do controle de qualidade prevê que cada amostra seja testada individualmente. Como o limite de quantificação e a linearidade também se referem a faixas de concentração e matrizes específicas, a transferência dos resultados para outras amostras sem novo teste não é permitida.

Fontes