Endotoxine & Sterilität: Was Sicherheits-Tests bei Peptiden prüfen

Warum chemische Peptid-Reinheit keine mikrobiologische Sicherheit garantiert

Ein Peptid kann chemisch rein sein - etwa zu 99 % per HPLC - und trotzdem Bakterienbestandteile oder lebende Keime enthalten. Chemische Reinheit und Identität bestätigen nur, was das Peptid ist und wie viel davon vorliegt, nicht aber, ob es mikrobiologisch belastet ist.

Deshalb gibt es separate mikrobiologische Sicherheitstests: den Endotoxintest (USP <85> / Ph. Eur. 2.6.14) und die Sterilitätsprüfung (USP <71> / Ph. Eur. 2.6.1). Diese Tests sind für injizierbare Peptide besonders relevant, weil sie direkt in Deinen Blutkreislauf gelangen.

Bakterielle Endotoxine nachweisen: Der LAL-Test für Peptide

Bakterielle Endotoxine sind eine Art Pyrogen - also Substanzen, die Fieber auslösen können, wenn sie in hoher Konzentration vorhanden sind. Der LAL-Test (Limulus-Amoebozyten-Lysat-Test) ist die gängige Methode, um solche Endotoxine nachzuweisen und zu quantifizieren.

Der Test ist in den großen Pharmakopöen harmonisiert: Ph. Eur. 2.6.14, JP 4.01 und USP <85> gelten in den ICH-Regionen als austauschbar. Es gibt drei Techniken (Gel-Clot, turbidimetrisch, chromogen), wobei der Gel-Clot-Limit-Test bei Streitigkeiten als letzte Instanz dient.

Die Ergebnisse werden in Endotoxin-Einheiten (EU) angegeben, kalibriert gegen den WHO-Internationalstandard. Übliche Messbereiche liegen bei 0,01-10 EU/mL, validierte Assays können bis 0,005 EU/mL nachweisen.

Für injizierbare Produkte gelten je nach Verabreichungsweg unterschiedliche Grenzwerte: Die pyrogene Schwellendosis (K) beträgt 5 EU/kg Körpergewicht/Stunde für die meisten parenteralen Wege, 0,2 EU/kg/Stunde für intrathekale (in den Spinalkanal) Gabe und 100 EU/m² Körperoberfläche/Stunde für Produkte, die auf dieser Basis dosiert werden. Der konkrete Grenzwert für ein Produkt wird mit der K/M-Formel berechnet, wobei M die maximale menschliche Dosis pro kg und Stunde ist.

Endotoxin-Kontamination kann aus Rohstoffen, Wassersystemen, Geräteoberflächen oder der Produktionsumgebung stammen. Die FDA weist darauf hin, dass LAL-Methoden 'inhärente Schwächen' haben, darunter Empfindlichkeitsschwankungen.

Sterilitätsprüfung bei Peptiden: Verfahren und Grenzen

Die Sterilitätsprüfung zeigt, dass in der getesteten Probe keine lebensfähigen Mikroorganismen vorhanden sind. Die harmonisierten Kapitel sind USP <71>, Ph. Eur. 2.6.1 und JP, harmonisiert unter ICH Q4B Annex 8.

Es gibt zwei Methoden: Membranfiltration und direkte Inokulation. Danach folgt eine mindestens 14-tägige Inkubation in zwei Kulturmedien (Fluid Thioglycollate Medium und Soybean-Casein Digest Medium). Vor der Aussagekraft muss die Methodeneignung (Bakteriostase/Fungistase) validiert werden.

Die Prüfung hat jedoch Grenzen: Sie basiert auf Stichproben - es wird nur eine Mindestanzahl von Einheiten pro Charge getestet. Die statistische Aussagekraft ist begrenzt; die Prüfung kann nicht jedes einzelne Vial einer Charge absichern. Die Nachweisgrenze beschreibt die kleinste Anzahl von Mikroorganismen, die unter den Bedingungen nachweisbar ist, aber der Nachweis bei niedrigen Keimzahlen ist probabilistisch.

Warum ein Peptid rein, aber mikrobiologisch belastet sein kann

Die chemische Reinheit sagt nichts über mikrobiologische Sicherheit aus. ICH Q6B, das für Proteine und Polypeptide gilt, listet Sterilität, Endotoxine und mikrobielle Grenzwerte explizit als eigene Spezifikationen, getrennt von physikochemischen Identitäts- und Reinheitstests.

Ein Analysezertifikat, das hohe chemische Reinheit ausweist, belegt keine mikrobiologische Sicherheit, es sei denn, es wurden spezifische Endotoxin- und Sterilitätstests durchgeführt und bestanden.

Leistungsumfang und Grenzen von Endotoxin- und Sterilitätstests

Der Endotoxintest (LAL/BET) bestätigt die Endotoxin-Konzentration in der getesteten Probe, bewertet gegen einen routenspezifischen Grenzwert. Er bestätigt keine Sterilität und keine Abwesenheit anderer Pyrogene. Die Sterilitätsprüfung bestätigt, dass in der getesteten Probe unter den angegebenen Bedingungen kein mikrobielles Wachstum nachweisbar ist - aber nicht die absolute Sterilität der gesamten Charge.

Beide Tests beziehen sich nur auf die konkret eingereichte Probe, nicht auf ungetestete Einheiten. Ein bestandenes Ergebnis gilt für die getestete Probe, nicht für die ganze Charge. Der LAL-Test erkennt nur bakterielle Endotoxine, nicht alle Pyrogene. Die Sterilitätsprüfung erfasst kultivierbare Bakterien und Pilze unter den Testbedingungen, nicht unbedingt alle lebensfähigen Organismen.

Quellen

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4. ICH Q4B Annex 14 Bacterial endotoxins tests - Scientific guideline | European Medicines Agency (EMA)
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21. USP 85: Bacterial Endotoxin Test - Nucro-Technics
22. Bacterial Endotoxins | USP
23. Sterility Testing USP <71> | Research Peptides Guide | American Peptides
24. Sterility Testing Guide: USP <71>, Direct Inoculation vs. Membrane Filtration, and B&F Validation | The Laboratory Outsourcing Network - Contract Laboratory