Pureza de péptidos

La pureza de un péptido es el porcentaje del péptido objetivo correcto en relación con impurezas similares a péptidos, como secuencias truncadas o desprotegidas de forma incompleta. La pureza por HPLC es una proporción derivada de los picos relacionados con péptidos en un cromatograma, no la masa total ni el contenido general de péptidos de la muestra.

La HPLC es el método estándar para calcular la pureza de péptidos

La cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (HPLC) separa las moléculas según su hidrofobicidad, es decir, la intensidad de su interacción con el agua. Una muestra disuelta atraviesa una columna especializada, donde el péptido objetivo y las impurezas relacionadas eluyen en momentos distintos y se registran como picos separados en un cromatograma.

La pureza se calcula dividiendo el área del pico objetivo entre el área total de todos los picos y multiplicando el resultado por 100. Este valor describe la proporción del péptido deseado dentro del material relacionado con péptidos.

La pureza por HPLC tiene limitaciones importantes en el análisis de péptidos

• La pureza por HPLC reporta una proporción, no la cantidad absoluta de péptido en el vial.
• No confirma la identidad molecular; se requiere una prueba secundaria como la espectrometría de masas (MS) para demostrar que el pico principal corresponde a la molécula prevista.
• Los contaminantes no peptídicos, como agua, sales o disolventes residuales, no se cuantifican mediante el valor de pureza por HPLC.
• La pureza del péptido no equivale al contenido neto de péptido (NPC); una muestra con un 99% de pureza puede contener aún una masa no peptídica significativa y menos miligramos activos de los esperados.
• Las impurezas pueden influir en los resultados de la investigación; por ello, los estudios de unión a receptores exigen péptidos particularmente puros.